PCR實驗室基礎知識

　　為了對以個特定序列進行PCR做重複檢測,需要三個不同的區域,每一個區域的具體技術操作（zuò）和試劑在（zài）下（xià）麵詳細列出

　　1、樣品準備區

　　這個區域專門（mén）用作樣品的準備，在（zài）製備和操作用於核酸提取的試劑時應該采

　　取預防措施：

　　1)PCR產物和（hé）帶有要（yào）擴增（zēng）序（xù）列的DNA克隆不能在這（zhè）個房（fáng）間操（cāo）作。

　　2)組織（zhī）培養物、組織（zhī）標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根（gēn）據應用的需要提取DNA或RNA。

　　3)用於樣品處理的工具不能被用作普通分（fèn）子克隆的工具，也不（bú）能用作操作靶序列。

　　4)DNA樣品應該用（yòng）有專門的防護或正壓活塞式移液管（guǎn）操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。

　　5)大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。

　　6)管子打開（kāi）前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產（chǎn）生氣溶膠。

　　7)任何時候都應該穿實（shí）驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其（qí）在抽提過程中每一步之間都要更換（huàn）。實驗服要專門用於樣品準備間（jiān），經常清洗。

　　2、樣品準備（bèi）和RNA-PCR

　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之（zhī）間汙染的機會。

　　3、前PCR區

　　必須有專門用於準備（bèi）各種反應的區（qū）域，這個區域必須保持幹淨（jìng），而且沒有來自克（kè）隆和樣品準備的汙染。前PCR區必（bì）須要有試劑和準備，特別是專門用於前PCR區的正壓活塞式移液管。

　　4、PCR實（shí）驗室（shì）試劑的操作

　　1)所（suǒ）用的（de）所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)汙（wū）染。

　　2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新（xīn）鮮蒸餾的去離子（zǐ）水，用0.22μm過濾的，並（bìng）且（qiě）是高壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯（zhù）存的試劑建議加點像疊（dié）氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品製備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑製擴（kuò）增反應。

　　4)所用試劑都應該以（yǐ）大體積配製（zhì），實驗一下看試（shì）劑是否滿意，然（rán）後分裝成僅夠一次使用的量進行貯（zhù）存。

　　5)所有試劑和樣品準備過程中都要使用一（yī）次性滅菌的瓶子和管子。

　　6)新配製的試劑在用於準備新的標本之（zhī）前應（yīng）該加以檢驗。

　　7)樣（yàng）品準備（bèi）和前PCR區所（suǒ）使用的移液管（guǎn）在（zài）不使用時都應該小心（xīn）保存（cún）。

　　5、在前PCR區建立PCR混合物

　　1)可以把即刻可（kě）用的“主混合（hé）物”溶液配好、分裝（zhuāng）並保存在-20℃或（huò）4℃，在實驗（yàn）室隻涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。

　　2)如果你的實驗室使用多套引物，以致於配製（zhì）包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟（jì），可以（yǐ）考（kǎo）慮分裝保存（cún）夠一天的PCR成分。

　　3)作為一個規則，應該保（bǎo）存一套陰性、弱陽性和強陽（yáng）性（xìng）對照樣品來分析樣品配製和PCR前過程的效（xiào）率和潔（jié）淨程度。而且，你也希望通過使用一個已知的（de）弱陽性樣品來驗證你（nǐ）的樣品緩（huǎn）衝液以證明裏麵不含擴增抑製物。